譜析分享：新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室儀器檢測技術指南
2020-01-29 10:18:22來源：admin
為指導各級疾控部門和其他相關機構開展新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測工作，特制定本技術指南。本指南主要介紹目前已經比較成熟、易于實施的核酸檢測方法。
一、標本采集
（一）采集對象。新型冠狀病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者，其他需要進行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進一步篩查檢測的環境或生物材料（如溯源分析）。
(二)標本采集要求。
1.從事新型冠狀病毒檢測標本采集的技術人員應經過生物安全培訓（培訓合格）和具備相應的實驗技能。采樣人員專業防護裝備（personal protective equipment，PPE）要求：N95口罩、護目鏡、防護服、乳膠手套、防水靴套；如果接觸患者血液、體液、分泌物或排泄物時，戴雙層乳膠手套。
2.住院病例的標本由所在醫院醫護人員在當地疾控機構專業人員指導下采集。
3．密切接觸者標本由當地疾控機構負責采集。
4．根據實驗室檢測工作的需要，可結合病程多次采樣。
（三）標本采集種類。每個病例必須采集急性期呼吸道標本和急性期血液標本；重癥病例優先采集下呼吸道標本（如支氣管或肺泡灌洗液等），可根據臨床表現與采樣時間間隔進行采集。
其他研究材料依據設計需求采集。
標本種類：
1．上呼吸道標本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。
2．下呼吸道標本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本。
3．血液標本：盡量釆集發病后7天內的急性期抗凝血。采集量5ml，以空腹血為佳，建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液。
4.血清標本：盡量釆集急性期、恢復期雙份血清。第一份血清應盡早（最好在發病后7天內）釆集，第二份血清應在發病后第3～4周釆集。采集量5ml，以空腹血為佳，建議使用真空釆血管。
（四）標本采集方法。
1．咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。
2．鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內鼻腭處，停留片刻后緩慢轉動退出。取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。
3．鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集器）。
4．深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的50ml螺口塑料管中。
5．支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集）。
6．肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管分支開口，經氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30~50 ml，總量100~250 ml，不應超過300 ml。
7．血液標本：建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，分別收集血漿和血液中細胞于無菌螺口塑料管中。
8.血清標本：用真空負壓采血管采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。
9．其他材料：依據設計需求規范采集。
（五）標本包裝。標本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內分裝。
1．所有標本應放在大小適合的帶螺旋蓋內有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。
2．將密閉后的標本放入大小合適的塑料袋內密封，每袋裝一份標本。
（六）標本保存。用于病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進行檢測，能在24小時內檢測的標本可置于4℃保存；24小時內無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清可在4℃存放3天，-20℃以下可長期保存。應設立專庫或專柜單獨保存標本。標本運送期間應避免反復凍融。
（七）標本送檢。標本采集后應盡快送往實驗室，如果需要長途運輸標本，建議采用干冰等制冷方式進行保藏。
1．上送標本：各?。ㄗ灾螀^、直轄市）首例檢測結果陽性、疑似聚集性病例及聚集性病例的標本，上送中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所進行檢測復核，并附樣本送檢表（見附件）。
2．病原體及標本運輸
2.1 國內運輸
新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應的聯合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI602分類包裝要求；環境樣本屬于B類，對應的聯合國編號為UN3373，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI650分類包裝要求；通過其他交通工具運輸的可參照以上標準包裝。
新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規定》（原衛生部令第45號）辦理《準運證書》。
2.2 國際運輸
新型冠狀病毒毒株或樣本在國際間運輸的，應規范包裝，按照《出入境特殊物品衛生檢疫管理規定》辦理相關手續，并滿足相關國家和國際相關要求。
二、新型冠狀病毒的實驗室檢測
新型冠狀病毒感染的常規檢測方法是通過實時熒光RT-PCR鑒定。任何新型冠狀病毒的檢測都必須在具備適當條件的實驗室由經過相關技術安全培訓的人員進行操作。本指南中的核酸檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。
在實驗室要確認一個病例為陽性，滿足以下條件：
同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。
陰性結果也不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括：樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。
三、實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸
（一）目的。規范實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的工作程序，保證實驗結果的正確可靠。
（二）范圍。適用于實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸。
（三）職責。
檢測人員：負責按照本檢測細則對被檢樣本進行檢測。
復核人員：負責對檢測操作是否規范以及檢測結果是否準確進行復核。
部門負責人：負責對科室綜合管理和檢測報告的審核。
（四）樣本接收和準備。核對被檢樣本姓名、性別、年齡、編號及檢測項目等；待檢樣本的狀態如有異常，需注明；待檢樣本應存放于-70℃冰箱保存。
（五）檢測項目。
1.新型冠狀病毒核酸測定（實時熒光RT-PCR方法）
推薦選用針對新型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區域的引物和探針。
靶標一（ORF1ab）：
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶標二（N）：
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
核酸提取和實時熒光RT-PCR反應體系參考相關廠家試劑盒說明。
2.結果判斷
陰性：無Ct值或Ct值>40。
陽性：Ct值<37，可報告為陽性。
可疑：Ct值在37-40之間，建議重復實驗，若Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。
四、病原生物安全實驗活動要求
根據目前掌握的新型冠狀病毒的生物學性狀、傳播特性、致病性、臨床資料等信息，考慮到新型冠狀病毒感染聚集性發病且有重癥病例，并有死亡病例的特點，實驗活動暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理，具體要求如下：
（一）病毒培養。指病毒的分離、培養、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產生活病毒的重組試驗等操作。利用活病毒或其感染細胞（或細胞提取物），不經滅活進行的生化分析、血清學檢測、免疫學檢測等操作視同病毒培養，上述操作應在具有開展相應活動資質的生物安全三級（Biological Safety Level 3,BSL-3）實驗室進行。使用病毒培養物提取核酸時，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養同等級別實驗室和防護條件下進行，可靠方法滅活后的病毒培養物，可在BSL-2或BSL-1級實驗室操作。
（二）動物感染實驗
指以活病毒感染動物的實驗。應在具有開展相應活動資質的動物（animal）BSL-3（ABSL-3）實驗室進行操作。
（三）未經培養的感染性材料的操作
未經培養的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸檢測、生化分析等操作，應在生物安全二級實驗室操作，但個人防護裝備參照生物安全三級實驗室的防護要求。未經可靠滅活或固定的人和動物組織標本因含病毒量較高，其操作的防護級別應比照病毒培養。
（四）滅活材料的操作
感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后可在BSL-1實驗室操作。
（五）無感染性材料的操作
指針對確認無感染性的材料的各種操作，包括但不限于無感染性的病毒DNA或cDNA操作，應在BSL-1實驗室進行。
